產(chǎn)品展示
                        PRODUCT DISPLAY
                        技術(shù)支持您現在的位置:首頁(yè) > 技術(shù)支持 > His-tag蛋白純化磁珠 技術(shù)說(shuō)明
                        His-tag蛋白純化磁珠 技術(shù)說(shuō)明
                      1. 發(fā)布日期:2018-05-22      瀏覽次數:3745
                        • His-tag蛋白純化篇
                          1.蛋白不吸附或親和力低
                          首先確認純化前的樣品中是否有目標蛋白。
                          (1)有目標蛋白,但大量穿透:
                          a、蛋白不含有標簽或未能正確表達
                          解決措施:Western Blot鑒定目標蛋白是否有His-Tag。若沒(méi)有,需要重新構建載體,添加組氨酸標簽,并確認標簽正確表達。
                          b、蛋白折疊導致組氨酸標簽未*暴露
                          解決措施:
                          在不變性條件下純化蛋白,在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素,這樣蛋白結構相對松散,而蛋白不會(huì )變性。
                          在變性條件下純化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。如果蛋白有二硫鍵,可加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇(在樣品中添加),可以改善蛋白的吸附。
                          重新構建載體,將組氨酸標簽換到另外一端,或在組氨酸標簽基因與目的基因之間增加一段Linker,可以降低蛋白折疊后標簽被掩蓋的幾率。
                          c、標簽太短  
                          解決措施:將標簽的組氨酸數量增加至6-10個(gè)。
                          d、蛋白標簽被水解
                          解決措施:添加合適的蛋白酶抑制劑;盡量在低溫下處理樣品;對于分泌表達的蛋白,長(cháng)時(shí)間存放將增加蛋白被降解的風(fēng)險,應盡快處理樣品。
                          e、蛋白溶解度偏低或聚集
                          解決措施:在結合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,減少蛋白聚集。
                          f、樣品及結合緩沖液不合適
                          解決措施:確認樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外,將樣品及結合緩沖液pH調節至7.4~8.5,有利于蛋白結合。
                          (2)有目標蛋白,但含量很低:
                          蛋白表達量低。解決措施:對樣品進(jìn)行濃縮,增加磁珠用量、延長(cháng)反應時(shí)間;優(yōu)化表達條件(誘導劑濃度、誘導溫度、誘導時(shí)間,培養基等);或更換其他合適的表達載體或表達系統。

                          2.純化得到的蛋白量少
                          (1)磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%,對于親和力較高的蛋白,每毫升磁珠懸液可結合的蛋白量約為3~4mg。用戶(hù)需要根據目標蛋白含量,使用足夠量的磁珠。對于親和力較低的蛋白,需要增加磁珠用量,延長(cháng)反應時(shí)間,或提高樣品及結合緩沖液pH。
                          (2)蛋白與磁珠親和力較低。參考問(wèn)題1。
                          (3)蛋白濃度低。對樣品進(jìn)行濃縮,或增加磁珠用量、延長(cháng)反應時(shí)間。
                          (4)磁珠重復使用次數太多。將磁珠進(jìn)行再生處理(參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))。

                          3.洗脫產(chǎn)物雜帶多什么原因?怎么處理?
                          (1)雜蛋白吸附。由于組氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白質(zhì)中很常見(jiàn)基團,而蛋白折疊可能導致幾個(gè)這樣的氨基酸殘基臨近,這樣也會(huì )使它們和磁珠的作用力增加??梢杂貌煌瑵舛鹊倪溥蜻M(jìn)行梯度洗脫,在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因為疏水相互作用導致非特異吸附,或使用鈷離子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要獲得純度較高的蛋白,需要對裂解、結合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進(jìn)行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白,則需要考慮使用多步純化,結合使用離子交換、凝聚過(guò)濾等純化方法。
                          (2)菌體破碎條件太劇烈導致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎;降低超聲破碎的強度,縮短時(shí)間;適當稀釋樣品,添加核酸酶,降低樣品粘稠度。
                          (3)蛋白被部分水解。添加合適的蛋白酶抑制劑,并盡可能在低溫下操作。

                          4.目標蛋白難洗脫
                          穿透組分中目標蛋白明顯減少,而洗脫組分中目標蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min,離心跑電泳,如果發(fā)現較多蛋白殘留。
                          (1)洗脫調節太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時(shí),可以嘗試降低洗脫液pH至4.0,但低pH會(huì )也導致金屬離子脫落,磁珠需要再生后再使用。
                          (2)蛋白吸附在磁珠上無(wú)法洗脫。對于非特異性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl濃度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100洗脫。對于聚集沉淀在磁珠上的蛋白(尤其注意含有二硫鍵的蛋白),可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進(jìn)行變性洗脫。

                          5.磁珠再生后,蛋白純化效果變差怎樣改善?
                          (1)再生過(guò)程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果,參考海貍生物醫學(xué)《組氨酸標簽蛋白純化試劑盒》說(shuō)明書(shū)中磁珠再生部分步驟4。
                          (2)重新掛金屬離子后為清洗干凈,需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結合,影響蛋白與磁珠的結合。

                          6.緩沖液中咪唑添加的意義
                          (1)結合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附;
                          (2)洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白;
                          (3)洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。

                          7.IDA-鎳和IDA-鈷的區別
                          IDA-鎳的蛋白載量高,40mg/mLgel,純度稍低,純度有90%。
                          IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mLgel,純度達到95%。
                          一般客戶(hù)建議購買(mǎi)IDA-鎳磁珠,即可達到目的。

                        魏經(jīng)理
                        • 手機

                          13120725556

                        日日狠狠久久8888偷偷色_国产一区二区三区在线观看免费_少妇无码一区二区不卡av_亚洲精品成人无码中文毛片不卡